Что называют разрешаемым расстоянием микроскопа. Микроскоп и микроскопические методы исследования

Технически возможно создать оптические микроскопы, объективы и окуляры которых дадут общее увеличение 1500-2000 и больше. Однако это нецелесообразно, так как возможность различить мелкие детали предмета ограничивается дифракционными явлениями. Вследствие этого изображение мельчайших деталей предмета теряет резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия изображения и предмета, соседние точки будут сливаться в одну, возможно полное исчезновение изображения. Поэтому в оптике существуют следующие понятия, которые характеризуют качество микроскопа:

Разрешающая способность микроскопа - свойство микроскопа давать раздельно изображение мелких деталей рассматриваемого предмета.

Предел разрешения - это наименьшее расстояние между двумя точками, которые видны в микроскопе раздельно.

Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность микроскопа!

Предел разрешения обусловливает наименьший размер деталей, которые могут различаться в препарате с помощью микроскопа.

Теорию разрешающей способности микроскопа разработал директор завода К.Цейса в Йене профессор-оптик Э.Аббе (1840-1905). В качестве простейшего микропрепарата он взял дифракционную решетку (рис. 2), изучил механизм формирования изображения в микроскопе и показал следующее.

Введем понятиеапертурного угла - это угол между крайними лучами конического светового пучка, идущего от середины объекта в объектив (рис. 3,а ). Для создания изображения, то есть для разрешения объекта, достаточно, чтобы в объектив попали лучи, образующие максимумы только нулевого и первого порядка хотя бы с одной стороны (рис. 2 и 3,б ). Участие в образовании изображения лучей от большего количества максимумов повышает качество изображения, его контраст. Поэтому лучи, образующие эти максимумы, должны быть в пределах апертурного угла объектива.

а) б) в) г)

1- фронтальная линза объектива, 2 - объектив

Таким образом, если объектом является дифракционная решетка с периодом d и свет падает на нее нормально (рис.2 и 3,б ), то в формировании изображения обязательно должны участвовать лучи, образующие максимумы нулевого и первого порядков с обеих сторон, а угол j 1 - угол отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, соответственно должен быть, в крайнем случае, равен углу U /2.

Если же взять решетку с меньшим периодом d ’, то угол j’ 1 будет больше угла U /2 и изображение не возникнет. Значит период решетки d можно принять за предел разрешения микроскопа Z . Тогда, используя формулу дифракционной решетки, запишем для k =1:

Заменяя d на Z , а j 1 на U /2, получим

. (6)

Во время микроскопии световые лучи падают на объект под разными углами. При наклонном падении лучей (рис.3,г ) предел разрешения уменьшается, так как в формировании изображения будут участвовать только лучи, образующие максимумы нулевого порядка и первого порядка с одной стороны, а угол j 1 будет равен апертурному углу U . Расчеты показывают, что формула для предела разрешения в этом случае принимает следующий вид:

. (7)

Если пространство между объектом и объективом заполнить иммерсионной средой с показателем преломления n , который больше показателя преломления воздуха, то длина волны света l n = l ¤ n . Подставляя это выражение в формулу для предела разрешения (7), получим

, или . (8)

Таким образом, формула (7) определяет предел разрешения для микроскопа с сухим объективом, а формула (8) -для микроскопа с иммерсионным объективом. Величины sin 0,5U и n× sin0,5U в этих формулах называют числовой апертурой объектива и обозначают буквой А . Учитывая это, формулу предела разрешения микроскопа в общем виде записывают так:

Как видно из формул (8) и (9), разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны света, величины апертурного угла, показателя преломления среды между объективом и объектом, угла падения световых лучей на объект, но она не зависит от параметров окуляра. Окуляр никакой дополнительной информации о структуре объекта не дает, качества изображения не повышает, он лишь увеличивает промежуточное изображение.

Разрешающая способность микроскопа может быть повышена за счет использования иммерсии и уменьшения длины волны света. Повышение разрешающей способности при использовании иммерсии можно пояснить следующим образом. Если между объективом и объектом находится воздух (сухой объектив), то световой луч при переходе из покровного стекла в воздух, среду с меньшим показателем преломления, значительно изменяет свое направление в результате преломления, поэтому меньше лучей попадает в объектив. При использовании иммерсионной среды, показатель преломления которой приблизительно равен показателю преломления стекла, изменение хода лучей в среде не наблюдается и большее количество лучей попадает в объектив.

В качестве иммерсионной жидкости берут воду (n =1,33), кедровое масло (n =1,515) и др. Если максимальный апертурный угол у современных объективов достигает 140 0 , то для сухого объектива А =0,94, а для объектива с масляной иммерсией А =1,43. Если при расчете использовать длину волны света l = 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз, то предел разрешения сухого объектива составит 0,30 мкм, а с масляной иммерсией - 0,19 мкм. Значение числовой апертуры указывается на оправе объектива: 0,20; 0,40; 0,65 и др.

Повышение разрешающей способности оптического микроскопа за счет уменьшения длины волны света достигается при использовании ультрафиолетового излучения. Для этого имеются специальные ультрафиолетовые микроскопы с кварцевой оптикой и приспособлениями для наблюдения и фотографирования объектов. Так как в этих микроскопах используется свет с длиной волны примерно в два раза меньше, чем у видимого света, то они способны разрешать структуры препарата размерами около 0,1мкм. Ультрафиолетовая микроскопия имеет еще одно преимущество - с ее помощью можно исследовать неокрашенные препараты. Большинство биологических объектов прозрачны в видимом свете, так как не поглощают его. Однако они обладают избирательным поглощением в ультрафиолетовой области и, следовательно, легко различимы в ультрафиолетовых лучах.

Наибольшая разрешающая способность у электронного микроскопа, так как длина волны при движении электрона в 1000 раз меньше длины световой волны.

Полезное увеличение микроскопа ограничено его разрешающей способностью и разрешающей способностью глаза.

Разрешающая способность глаза характеризуется наименьшим углом зрения, при котором человеческий глаз еще различает раздельно две точки предмета. Она лимитируется дифракцией на зрачке и расстоянием между светочувствительными клетками сетчатки. Для нормального глаза наименьший угол зрения равен 1 минуте. Если предмет находится на расстоянии наилучшего зрения - 25 см, то этот угол соответствует предмету размером 70 мкм. Данную величину считают пределом разрешения невооруженного глаза Z r на расстоянии наилучшего зрения. Однако показано, что оптимальная величина Z r равна 140-280 мкм. При этом глаз испытывает наименьшее напряжение.

Полезным увеличением микроскопа называют его максимальное увеличение, при котором глаз еще в состоянии различать детали, равные по величине пределу разрешения микроскопа.

Линейное увеличение микроскопа равно отношению величины изображения предмета, расположенного на расстоянии наилучшего зрения, к величине самого предмета (см. формулу 1). Если за размер предмета примем предел разрешения микроскопа Z , а за размер изображения - предел разрешения невооруженного глаза на расстоянии наилучшего зрения Z r , то получим формулу полезного увеличения микроскопа:

Подставляя в эту формулу Z из выражения (9), получим

. (11)

Подставив в формулу (11) длину волны света 555 нм (555×10 -9 м), оптимальные величины пределов разрешения глаза 140-280 мкм (140-280×10 -6 м), найдем интервал значений полезного увеличения микроскопа

500 А < К п < 1000 А .

Например, при использовании лучших иммерсионных объективов с числовой апертурой 1,43 полезное увеличение будет составлять 700-1400, отсюда видно, что конструировать оптические микроскопы с большим увеличением нецелесообразно. Однако в настоящее время этот вопрос потерял свою остроту в связи с широким использованием в биологии и медицине электронного микроскопа, обеспечивающего увеличение до 600 000, а предел разрешения - до 0,1 нм.

Микроскоп, как оптический прибор. Разрешающая способность микроскопа.

Микроскоп (от микро... и греческого skopeo — смотрю) - это оптический прибор для получения сильно увеличенного изображения изучаемого очень маленького объекта, невидимого невооружённым глазом. При помощи микроскопа можно рассмотреть мелкие детали строения объекта, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.

Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, которая характеризуется определённым разрешением. Разрешением оптической системы называется наименьшее расстояние между элементами наблюдаемого объекта, при котором эти элементы ещё могут быть отличены один от другого (под элементами объекта мы понимаем точки или линии).

Если объект удален на так называемое расстояние наилучшего видения, которое составляет250 мм, то для нормального человеческого глаза минимальное разрешение составляет примерно0,1 мм, а у многих людей — около0,2 мм. Примерно это соответствует толщине человеческого волоска. Размеры объектов, таких как растительные и животные клетки, мелкие кристаллы, детали микроструктуры металлов и сплавов и т.п., значительно меньше0,1 мм. Такие объекты принято называть микрообъекты. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопа определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Оптический микроскоп даёт возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм, т.е. разрешающая способность такого микроскопа составляет около 0,20 мкм или 200 нм.

Когда говорят о разрешающей способности микроскопа, подразумевают, также как и под разрешающей способностью человеческого глаза, раздельное изображение двух близко расположенных объектов. Однако, нужно понимать, что разрешающая способность и увеличение - это не одно и тоже. Например, если при помощи систем визуализации получить со светового микроскопа фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,20 мкм (т.е. менее разрешающей способности микроскопа), то, как бы мы не увеличивали изображение, линии все равно будут сливаться в одну. Т.е. мы сможем получить большое увеличение, но не улучшим его разрешение. Общее увеличение микроскопа равно произведению линейного увеличения объектива на угловое увеличение окуляра. Значения увеличений гравируются на оправах объективов и окуляров. Рассмотрим микроскоп плоского поля (не стереоскопический). Это биологические микроскопы, металлографические, поляризационные. Обычно объективы такого микроскопа имеют увеличения от 4 до 100 крат, а окуляры — от 5 до 16. Поэтому общее увеличение оптического микроскопа лежит в пределах от 20 до 1600 крат. Разумеется, технически возможно разработать и применить в микроскопе объективы и окуляры, которые дадут общее увеличение, значительно превышающее 1600 крат (например, существуют окуляры с увеличением 20 крат, которые в паре с объективом 100 крат дадут увеличение 2000 крат). Однако, обычно это нецелесообразно. Большие увеличения не являются самоцелью оптической микроскопии. Назначение микроскопа состоит в том, чтобы обеспечить различение как можно более мелких элементов структуры препарата, т.е. в максимальном использовании разрешающей способности микроскопа. А она имеет предел, обусловленный волновыми свойствами света. Таким образом, различают полезное и неполезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение - это когда можно выявить новые детали строения объекта, а неполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения объекта.

Еще раз остановимся на понятии разрешающей способности. Разрешающая способность оптических приборов (так же ее называют разрешающая сила) характеризует способность этих приборов давать раздельные изображения двух близких друг к другу точек объекта. Наименьшее линейное или угловое расстояние между двумя точками, начиная с которого их изображения сливаются, называется линейным или угловым пределом разрешения. Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличений, которые мы получаем с помощью микроскопа. Увеличения до 1250 крат называют полезными, т. к. при них мы различаем все элементы структуры объекта. При этом возможности микроскопа по разрешающей способности исчерпываются. Это увеличение получаем при использовании объектива 100 крат, работающего с масляной иммерсией, и окуляра 12,5 крат (полезное увеличение окуляров лежит от 7,5 до 12,5 крат). При увеличениях свыше 1250 крат не выявляются никакие новые детали структуры препарата. Однако иногда такие увеличения используют — в микрофотографии, при проектировании изображений на экран и в некоторых других случаях.

Когда необходимо существенно более высокое полезное увеличение, используют электронный микроскоп. Этот микроскоп обладает существенно более высокой разрешающей способностью, нежели оптический микроскоп. Электронный микроскоп - это прибор для наблюдения и фотографирования многократно (до 106 раз) увеличенного изображения объектов, в котором вместо световых лучей используются пучки электронов, ускоренных до больших энергий (30—100 кэв и более) в условиях глубокого вакуума.

Классификация световых микроскопов и области их применения

По строению оптической схемы различают прямые (объективы, насадка и окуляры расположены над объектом) и инвертированные (объект находится над оптической системой, формирующей изображение) микроскопы. Также различают микроскопы плоского поля (дающие двухмерное изображение) и стереоскопические микроскопы (объемное - трехмерное изображение).

По способам освещения разделяют микроскопы проходящего света (изображение формируется светом, проходящим через объект) и отраженного света (изображение формируется светом, отраженным от поверхности объекта).

Микроскопы можно разделить также по методам исследования:

Светлого поля (на светлом фоне выделяется более темный объект);

Темного поля (на темном фоне выделяется светлый объект или его краевые структуры);

Фазового контраста (на светло-сером фоне наблюдается темно-серый рельефный объект);

Люминесценции (на темном фоне выделяются светящиеся объекты или части объекта);

Поляризованного света (наблюдается ярко окрашенное в различные цвета или оттенки изображение объекта).

Можно выделить следующиеобласти применения световых микроскопов:

Биологические микроскопыдля лабораторных биологических и медицинских исследований прозрачных объектов. Доступны режимы светлого и темного поля, фазовый контраст, поляризованный и люминесцентный свет.

Стереоскопические микроскопыв лабораториях и на различных производствах для получения увеличенных изображений объектов во время проведения рабочих операций. Возможна работа в отраженном и проходящем свете. Доступны режимы светлого и темного поля.

Металлографические микроскопыв научных и промышленных лабораториях для исследования непрозрачных объектов. Работа в отраженном свете. Доступны режимы светлого и темного поля, фазовый контраст, поляризованный свет.

Поляризационные микроскопыв научных и исследовательских лабораториях для специализированных исследований в поляризованном свете. Возможна работа в отраженном и проходящем свете. Доступны режимы светлого и темного поля.

Объективы и окуляры для микроскопов

Объектив микроскопа - микрообъектив представляет собой сложную оптическую систему, образующую увеличенное изображение объекта, и является основной и наиболее ответственной частью микроскопа. Микрообъектив создает действительное перевернутое изображение, которое рассматривается через окуляр.

Объективы различаются по оптическим характеристикам и конструкции:

По степени исправления хроматической аберрации: ахроматы, апохроматы и др.

С исправленной кривизной изображения: - планахроматы, планапохроматы.

По длине тубуса микроскопа -160 ммдля проходящего света,190 ммдля отраженного света, бесконечность - для проходящего и отраженного света;

По свойствам иммерсии: сухие системы (без иммерсии) и иммерсионные системы.

Объективы апохроматы отличаются от ахроматов степенью исправления хроматической аберрации. Благодаря более совершенному устранению дефектов изображения, связанных с хроматической аберрацией, качество изображения, получаемого при наблюдении цветных объектов (окрашенные срезы, микроорганизмы и т.п.), особенно при больших увеличениях, значительно выше при использовании апохроматов. Апохроматы, а также ахроматы большого увеличения применяются совместно с компенсационными окулярами. На оправе апохроматов обычно выгравировано АПО (APO). У ахроматов и апохроматов, особенно большого увеличения, остается неисправленной кривизна поля изображения.

Разрешающая способность глаза ограничена. Разрешающая способность характеризуется разрешаемым расстоянием , т.е. минимальным расстоянием между двумя соседними частицами, при котором они еще видимы раздельно. Разрешаемое расстояние для невооруженного глаза составляет около 0,2 мм. Для увеличения разрешающей способности используют микроскоп. Для исследования строения металлов микроскоп был впервые применен в 1831 году Аносовым П.П., изучавшим булатную сталь, и позднее, в 1863 году англичанином Г. Сорби, изучавшим метеоритное железо.

Разрешаемое расстояние определяется соотношением:

где l - длина волны света, идущего от объекта исследования в объектив, n – показатель преломления среды, находящейся между объектом и объективом, и a - угловая апертура, равная половине угла раскрытия, входящего в объектив пучка лучей, дающих изображение. Эта важная характеристика объектива выгравирована на его оправе.

У хороших объективов максимальный апертурный угол a = 70° и sina » 0,94. В большинстве исследований применяют сухие объективы, работающие в воздушной среде (n = 1). Для уменьшения разрешаемого расстояния используют иммерсионные объективы. Пространство между объектом и объективом заполняют прозрачной жидкостью (иммерсией) с большим показателем преломления. Обычно используют каплю кедрового масла (n = 1,51).

Если для видимого белого света принять l = 0,55 мкм, то минимальное разрешаемое расстояние светового микроскопа:

Таким образом, разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной волны света. Объектив дает увеличение промежуточного изображения объекта, которое рассматривается в окуляр, как в лупу. Окуляр увеличивает промежуточное изображение объекта и не может повысить разрешающей способности микроскопа.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра. На металлографических микроскопах производят исследования структуры металлов с увеличением от 20 до 2000 раз.

Начинающие делают обычную ошибку, стремясь рассматривать структуру сразу же при большом увеличении. Следует иметь в виду, что чем больше увеличение объекта, тем меньший участок виден в поле зрения микроскопа. Поэтому рекомендуется начинать исследование с использования слабого объектива, чтобы вначале оценить общий характер структуры металла на большой площади. Если же начинать микроанализ с использования сильного объектива, то многие важные особенности структуры металла могут быть не замечены.

После общего просмотра структуры при малых увеличениях микроскопа выбирают объектив с такой разрешающей способностью, чтобы увидеть все необходимые самые мелкие детали структуры.

Окуляр выбирают так, чтобы четко были видны детали структуры, увеличенные объективом. При недостаточном увеличении окуляра мелкие детали промежуточного изображения, созданного объективом, не будут увидены в микроскоп, и, таким образом, разрешающая способность объектива полностью не будет использована. При слишком большом увеличении окуляра новые детали структуры не выявляются, в то же время контуры уже выявленных деталей окажутся размытыми, а поле зрения станет более узким. Собственное увеличение окуляра выгравировано на его оправе (например, 7 х).

Разрешающая способность микроскопа характеризуется величиной, обратной линейному пределу разрешения. Согласно дифракционной теории Аббе линейный предел разрешения микроскопа, т. е. минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, определяется по формуле

где линейный предел разрешения; длина волны света, в котором проводится наблюдение; А - числовая апертура, или просто апертура, микроскопа (микрообъектива).

Из формулы (324) следует, что для повышения разрешающей способности микроскопа нужно уменьшать длину волны света и увеличивать числовую апертуру микроскопа. Первая возможность реализуется путем фотографирования исследуемых предметов в ультрафиолетовом излучении.

Апертура микроскопа определяется по формуле где Значение апертурного угла современных высококачественных микрообъективов доведено практически до предела.

Другая возможность увеличения апертуры - применение иммерсионной жидкости, помещаемой между рассматриваемым предметом и микрообъективом. В качестве такой жидкости используют воду кедровое масло монобромнафталин

Чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, определяемую по формуле (324), необходимо иметь соответствующее видимое увеличение. Если две точки передней фокальной плоскости оптической системы расположены друг от друга на линейном расстоянии (рис. 157), то

Рис. 157. Схема для определения полезного увеличения микроскопа

угловое расстояние между этими точками в пространстве изображений

Глаз наблюдателя будет воспринимать эти точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза

Из формул (325), (324) и (317) следует, что видимое увеличение микроскопа

По последней формуле можно определить минимальное видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа. Это увеличение называется полезным. При использовании формулы (326) следует иметь в виду, что во многих случаях диаметр выходного зрачка микроскопа составляет Это приводит к увеличению углового предела разрешения глаза до Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра то при угловом пределе разрешения глаза согласно (326) для полезного увеличения микроскопа получим.

Как известно, основную долю информации об окружающем мире человек получает с помощью зрения. Глаз человека - сложный и совершенный прибор. Этот созданный природой прибор работает со светом - электромагнитным излучением, диапазон длин волн которого находится между 400 и 760 нанометрами. Цвет, который при этом воспринимает человек, изменяется от фиолетового до красного.

Электромагнитные волны, соответствующие видимому свету, взаимодействуют с электронными оболочками атомов и молекул глаза. Результат этого взаимодействия зависит от того, в каком состоянии находятся электроны этих оболочек. Свет может поглощаться, отражаться или рассеиваться. Что именно произошло со светом, может многое рассказать об атомах и молекулах, с которыми он взаимодействовал. Диапазон размеров атомов и молекул от 0,1 до десятков нанометров. Это во много раз меньше, чем длина волны света. Тем не менее, объекты именно таких размеров - назовем их нанообъектами - очень важно увидеть. Что же надо для этого сделать? Обсудим сначала, что может рассмотреть человеческий глаз.

Обычно, когда говорят о разрешающей способности того или иного оптического прибора, оперируют двумя понятиями. Одно из них - угловое разрешение, а второе - линейное разрешение. Эти понятия взаимосвязаны. К примеру, для человеческого глаза угловое разрешение составляет приблизительно 1 угловую минуту. При этом глаз может различить два точечных объекта, удаленных от него на 25–30 см, только тогда, когда расстояние между этими объектами больше чем 0,075 мм. Это вполне сравнимо с разрешением обычного компьютерного сканера. В самом деле, разрешение 600 точек на дюйм означает, что сканер может различить точки, расположенные на расстоянии 0,042 мм друг от друга.

Для того чтобы можно было различать объекты, расположенные на еще меньших расстояниях друг от друга, был придуман оптический микроскоп - прибор, увеличивающий разрешающую способность глаза. Выглядят эти приборы по-разному (что видно из рисунка 1), но принцип действия у них один тот же. Оптический микроскоп позволил отодвинуть предел разрешения до долей микрона. Уже 100 лет назад оптическая микроскопия сделала возможным изучать объекты микронных размеров. Однако тогда же стало ясно, что простым увеличением количества линз и улучшением их качества добиться дальнейшего увеличения разрешающей способности невозможно. Разрешение оптического микроскопа оказалось ограничено свойствами самого света, а именно его волновой природой.

Еще в конце позапрошлого века было установлено, что разрешение оптического микроскопа составляет . В этой формуле λ - длина волны света, а n sin u - числовая апертура объектива микроскопа, которая характеризует как микроскоп, так и то вещество, которое находится между объектом изучения и самой близкой к нему линзой микроскопа. И действительно, в выражение для числовой апертуры входят показатель преломления n среды, находящейся между объектом и объективом, и угол u между оптической осью объектива и самыми крайними лучами, которые выходят из объекта и могут попасть в этот объектив. Показатель преломления вакуума равен единице. У воздуха этот показатель очень близок к единице, у воды он составляет 1,33303, а у специальных жидкостей, используемых в микроскопии для получения максимального разрешения, n доходит до 1,78. Каким бы ни был угол u , величина sin u не может быть больше единицы. Таким образом, разрешение оптического микроскопа не превышает долей длины волны света.

Обычно считается, что разрешение составляет половину длины волны.

Интенсивность, разрешение и увеличение объекта - разные вещи. Можно сделать так, что расстояние между центрами изображений объектов, которые расположены в 10 нм друг от друга, будет 1 мм. Это будет соответствовать увеличению в 100 000 раз. Тем не менее, различить, один это объект или два, не получится. Дело в том, что изображения объектов, размеры которых очень малы по сравнению с длиной волны света, будут иметь одинаковые форму и размеры, не зависящие от формы самих объектов. Такие объекты называют точечными - их размерами можно пренебречь. Если такой точечный объект светится, то оптический микроскоп изобразит его в виде светлого кружка, окруженного светлыми и темными кольцами. Будем далее, для простоты, рассматривать именно источники света. Типичное изображение точечного источника света, полученное с помощью оптического микроскопа, показано на рисунке 2. Интенсивность светлых колец намного меньше, чем у кружочка, и убывает по мере удаления от центра изображения. Чаще всего видно только первое светлое кольцо. Диаметр первого темного кольца равен . Функция, которая описывает такое распределение интенсивности, называется функцией рассеяния точки. Эта функция не зависит от того, каково увеличение. Изображение нескольких точечных объектов будет представлять собой именно круги и кольца, как это видно из рисунка 3. Полученное изображение можно увеличивать, однако если изображения двух соседних точечных объектов сливаются, то они будут сливаться и дальше. Такое увеличение часто называют бесполезным - большие изображения просто будут более размытыми. Пример бесполезного увеличения показан на рисунке 4. Формула часто называется дифракционным пределом, и она настолько знаменита, что именно ее высекли на памятнике автору этой формулы - немецкому физику-оптику Эрнсту Аббе.

Конечно, со временем оптические микроскопы стали снабжать разнообразными устройствами, позволяющими запоминать изображения. Человеческий глаз дополнили сначала пленочные фото- и кинокамеры, а потом - камеры, в основе которых лежат цифровые устройства, преобразующие попадающий на них свет в электрические сигналы. Самыми распространенными из таких устройств являются ПЗС-матрицы (ПЗС расшифровывается как прибор с зарядовой связью). Количество пикселей в цифровых камерах продолжает расти, однако само по себе это не может улучшить разрешение оптических микроскопов.

Еще двадцать пять лет назад казалось, что дифракционный предел непреодолим и что, для того чтобы изучать объекты, размеры которых во много раз меньше, чем длина волны света, необходимо отказаться от света как такового. Именно таким путем пошли создатели электронных и рентгеновских микроскопов. Несмотря на многочисленные преимущества таких микроскопов, задача использования именно света для рассматривания нанообъектов оставалась. Причин для этого было много: удобство и простота работы с объектами, небольшое время, которое требуется для получения изображения, известные способы окрашивания образцов и многое другое. Наконец, после долгих лет напряженной работы стало возможным рассматривать нанообъекты с помощью оптического микроскопа. Наибольший прогресс в этом направлении достигнут в области люминесцентной микроскопии. Конечно, дифракционный предел никто не отменял, но его удалось обойти. В настоящее время существуют различные оптические микроскопы, позволяющие рассматривать объекты, размеры которых намного меньше длины волны того самого света, который создает изображения этих объектов. Все эти приборы объединяет один общий принцип. Попробуем пояснить, какой именно.

Из того, что уже говорилось о дифракционном пределе разрешения, ясно, что увидеть точечный источник не так уж сложно. Если этот источник обладает достаточной интенсивностью, его изображение будет отчетливо видно. Форма и размер этого изображения, как уже говорилось, будут определяться свойствами оптической системы. При этом, зная свойства оптической системы и будучи уверенными в том, что объект точечный, можно определить, где именно находится объект. Точность определения координат такого объекта достаточно высока. Иллюстрацией этого может служить рисунок 5. Координаты точечного объекта можно определить тем точнее, чем интенсивнее он светится. Еще в 80-х годах прошлого века с помощью оптического микроскопа умели определять положение отдельных светящихся молекул с точностью в 10–20 нанометров. Необходимым условием столь точного определения координат точечного источника является его одиночество. Ближайший к нему другой точечный источник должен находиться настолько далеко, чтобы исследователь точно знал, что обрабатываемое изображение соответствует одному источнику. Понятно, что это расстояние l должно удовлетворять условию . В этом случае анализ изображения может дать очень точные данные о положении самого источника.

Большинство объектов, размеры которых намного меньше разрешающей способности оптического микроскопа, можно представить как набор точечных источников. Источники света в таком наборе находятся друг от друга на расстояниях, намного меньших величины . Если эти источники будут светить одновременно, то сказать что-либо о том, где именно они расположены, будет невозможно. Тем не менее, если суметь заставить эти источники светить по очереди, то положение каждого них можно определить с высокой точностью. Если эта точность превышает расстояние между источниками, то, обладая знанием о положении каждого из них, можно узнать о том, каково их взаимное расположение. А это означает, что получена информация о форме и размерах объекта, который представлен как набор точечных источников. Другими словами, в таком случае можно рассмотреть в оптический микроскоп объект, размеры которого меньше, чем дифракционный предел!

Таким образом, ключевым моментом является получение информации о различных частях нанообъекта независимо друг от друга. Существуют три основные группы методов, позволяющие сделать это.

Первая группа методов целенаправленно заставляет светить ту или иную часть исследуемого объекта. Самый известный из этих методов - сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля. Рассмотрим ее подробнее.

Если внимательно изучить те условия, которые подразумеваются, когда речь идет о дифракционном пределе, обнаружится, что расстояния от объектов до линз значительно больше длины волны света. На расстояниях, сравнимых и меньших этой длины волны, картина получается другой. Вблизи любого объекта, попавшего в электромагнитное поле световой волны, существует переменное электромагнитное поле, частота изменения которого такая же, как частота изменения поля в световой волне. В отличие от световой волны, это поле быстро затухает по мере удаления от нанообъекта. Расстояние, на котором происходит уменьшение интенсивности, например, в e раз, сравнимо с размерами объекта. Таким образом, электромагнитное поле оптической частоты оказывается сконцентрированным в объеме пространства, размер которого намного меньше, чем длина волны света. Любой нанообъект, попавший в эту область, будет так или иначе взаимодействовать со сконцентрированным полем. Если тот объект, с помощью которого осуществляется это концентрирование поля, последовательно перемещать по какой-либо траектории вдоль изучаемого нанообъекта и регистрировать свет, излучаемый этой системой, то можно построить изображение по отдельным точкам, лежащим на этой траектории. Конечно, в каждой точке изображение будет выглядеть так, как показано на рисунке 2, но разрешение при этом будет определяться тем, насколько удалось сконцентрировать поле. А это, в свою очередь, определяется размерами того объекта, с помощью которого это поле концентрируется.

Самым распространенным способом такой концентрации поля является изготовление очень маленького отверстия в металлическом экране. Обычно это отверстие находится на конце заостренного и покрытого тонкой пленкой металла световода (световод часто называется оптическим волокном и широко используется для передачи данных на большие расстояния). Сейчас удается изготавливать отверстия с диаметрами от 30 до 100 нм. Таким же по величине получается и разрешение. Приборы, работающие по этому принципу, и называются сканирующими оптическими микроскопами ближнего поля. Они появились 25 лет тому назад.

Суть второй группы методов сводится к следующему. Вместо того чтобы заставлять соседние нанообъекты светить по очереди, можно использовать объекты, которые светятся разными цветами. В этом случае с помощью светофильтров, пропускающих свет того или иного цвета, можно определять положение каждого из объектов, а потом - составлять единую картину. Это очень похоже на то, что изображено на рисунке 5, только цвета для трех изображений будут различными.

Последняя группа методов, позволяющих преодолеть дифракционный предел и рассмотреть нанообъекты, использует свойства самих светящихся объектов. Существуют такие источники, которые можно «включать» и «выключать» с помощью специально подобранного света. Такие переключения происходят статистически. Иначе говоря, если имеется много переключаемых нанообъектов, то, подобрав длину волны света и его интенсивность, можно заставить «выключиться» только часть из этих объектов. Остальные объекты будут продолжать светить, и можно получить от них изображение. После этого надо «включить» все источники и снова «выключить» часть из них. Набор оставшихся «включенными» источников будет отличаться от набора, который остался «включенным» в первый раз. Повторяя такую процедуру много раз, можно получить большой набор изображений, отличающихся друг от друга. Анализируя такой набор, можно установить местоположение большой доли всех источников с очень высокой точностью, значительно превышающей дифракционный предел. Пример сверхразрешения, полученного таким способом, приведен на рисунке 6.

В настоящее время оптическая микроскопия со сверхразрешением быстро развивается. Можно со всей уверенностью предполагать, что в грядущие годы эта область будет привлекать все большее число исследователей, и хочется верить, что среди них будут и читатели этой статьи.